Ворота яксель: Система якселя для откатных ворот своими руками — Alex_Welder

Содержание

Система якселя для откатных ворот своими руками — Alex_Welder

Доброго всем дня уважаемые читатели. Данный пост решил написать про прошлогоднюю свою работу которую сделал в начале октября)

Итак: Главное условие заказчика — ширина ворот, так как ворота предназначены для проезда большегрузной техники. Распашные в силу того что занимают большое пространство и крадут много полезной площади мы отмели сразу. Вторым условием ворот была бюджетность, так как вкупе с этими воротами еще и надо было закрыть забором около 100 метров периметра участка. Таким образом, посидев и подумав остановились на единственно доступном варианте откатных ворот — причем своими руками. Я к тому времени уже был готов закупить готовые (заводские) направляющие, ролики, уловители и тд., когда увидел в ютубе систему откатных ворот системы якселя.

После некоторого количества просмотров, чтения комментариев к видео и к картинкам, усиленного репочесания и подсчета материалов, обрел уверенность в том что воротам быть, и именно в таком виде.

Пришлось конечно изрядно попотеть, да и времени заняло немало… но тем не менее результат того стоил.

Вот что получилось в итоге в конце концов)))

@alex_welder01

Первым делом собрал и сварил подшипники для направляющей основы будущих ворот. Под размер профильной трубы 100х100

Особенность системы якселя в том, что основа ставится ребром в отличии от других видов откатных систем.

Процесс сварки основы.

Далее доварил собственно каркас ворот и протестировал механизм)

После покраски

Итоговый вид изнутри

Ну и в конце несколько фотографий проделанной работы)))

Как сделать надежные и бюджетные откатные ворота самому. | Все для дома

Всем большой привет!!!

Те кто живет в домах на земле т. е. в частных котеджах, или имеет дачи, практических у всех есть ворота для заезда автомобиля во двор. Во времена СССР особо не заморачивались и делали распашные ворота, так как они самые простые в изготовлении да и металла в то время было в излишке и за копейки. Вот и я приобрел частный домик во дворе которого были обычные распашные ворота изготовленные из уголка.

К тому же они были прозрачные из высечки. Меня такой вариант не устраивал, так как открывались они уже плохо, были немного поведенные, толи от времени толи от кривых рук их создателя. Решил я заморочиться и сделать откатные ворота, но чтобы они были надежные, не дорогие, простые в изготовлении и удобные в использовании. Вот принципе такие критерии я хотел соблюсти. Начал искать варианты в глобальной сети -Интернет. Честно говоря вариантов было не мало, но больше всего мне понравился вот такой вариант о котором я вам расскажу и покажу.

Основное что нужно было сделать в начале, это взять швеллер и надежно его забетонировать в земле, предварительно выкопав яму. Слава богу кусок швеллера у меня был в закромах, его я и буду использовать. Но чтобы он сидел в земле надежно (водь вся нагрузка от ворот будет на нём), я приварил к нему два куска швеллера и отрезки разного металлолома, для лучшего и надежного сцепления так сказать.

Затем выкопал яму и забетонировал там эту конструкцию выставив все на нужно высоте и строго по уровню.

Далее из 50 уголка нужно изготовить две одинаковые детали. Для этого отпиливаем два отрезка по 150мм и 4 по 100 мм.

Теперь при помощи сварки соединяем их.

Должно получится примерно так:

Также мне понадобилось 8 подшипников закрытого типа под номером 204.

И такое же количество болтов на 20 с шайбами и гайками.

Болты нужно приварить к деталям которые я изготовил из уголка, а на них уже одеть подшипники и приварить к швеллеру на расстоянии друг от друга 120 см.

Основанием которое будет ездить между подшипниками будет служить профильная труба 60*60.

На нее сверху привариваем профильную трубу 40*40 мм.

С противоположной стороны нужно приварить к столбу замок уловитель, он будет фиксировать ворота в закрытом состоянии.

Теперь остается сварить каркас ворот. его буду делать из профтрубы 40*40 мм.

Далее ворота красятся и обшиваются профлистом в цвет.

Получились не хуже заводских. Специально для вас мои дорогие читатели я снял подробное видео изготовления этих ворот, желаю приятного просмотра:

Большая просьба, если вы заметили в статье ошибки, напишите об этом в комментариях.

Подписывайтесь на мой канал Все для дома , также поделитесь понравившейся статьёй в соцсетях со своими друзьями и знакомыми. Всем спасибо за просмотр.

Ворота из профнастила по чертежам и схемам

Главная › Новости

Опубликовано: 01.09.2018

Откатные ворота своими руками (відкатні ворота своїми руками) – инструкция, схемы

Современное строительство шагнуло далеко вперед по использованию материалов, не требующих больших капиталовложений, имеющих длительный срок эксплуатации благодаря техническим показателям, дающих возможность самостоятельно выполнить монтажные работы качественно. Профнастил служит примером таких материалов. Выполнение облицовочных работ с помощью оцинкованного металлического листа под силу даже начинающему строителю.


Откатные ворота своими руками Дёшево Схема Яксель Чертежи

Схема распашных ворот из профлиста

Профильные заборы прочно заняли место среди самых модных конструкций и продолжают служить примером актуальных и недорогостоящих проектов.

Центральной фигурой конструкции, естественно, служат ворота. Можно изготовить их из другого материала, но, чтобы поддержать общий рисунок ограждения, профнастил подойдет по всем показателям.

Начальные этапы работы по подготовке проекта

Постройка ворот непосвященному кажется сложной, труднодоступной. Причинами распространенного заблуждения служит необходимость установки конструкции в одну линию с основным ограждением, при этом она должна иметь подвижную составляющую, не перекоситься под собственным весом влево или вправо, сохранить презентабельный вид в центре композиции. Определиться с размером и строением необходимо в самом начале работы. Местоположение и размеры распахивающихся створок определяют оптимальным для заезда транспорта, традиционно располагая по центру фасада основного здания.

  фасад из профлиста

Выбор необходимых комплектующих, из которых будут складываться ворота, включая самые мелкие детали, даст возможность правильно рассчитать количество профнастила, крепежного материала, размеры петель. Оптимальные размеры створок ворот — от трех до пяти метров в ширину, два с половиной в высоту . Ворота можно сделать выдвижными, установив параметры по своему усмотрению, не забывая о легкости профнастила и возможной амплитуде колебаний плоскости в ветреную погоду. Построить ворота без внесения срочных конструктивных изменений во время этапа обшивки профнастилом поможет точное указание всех параметров в чертеже.

размеры профилированного листа

Построение чертежа

Даже если чертеж представляет собой схематический набросок, необходимо точно проставить все размеры и прорисовать отдельные полотна и конструкции. Ограниченное пространство, когда, например, необходимо «втиснуть» полноценные ворота в узкий проем, может определить объединение распахивающейся створки с воротами. Размеры и конструкция рамы выводятся отдельно. Проект основания — ответственный момент. Несущая конструкция высоких полотен предполагает большее количество поперечных балок в воротах.

Длину усилят вертикальные ребра жесткости.

  распашные ворота из профнастила

Схема ворот

Определившись, в какую сторону будут открываться ворота, проектируют расположение калитки, возможно, нескольких. Планируя высоту сооружения, учитывается размер калитки, не менее метра восьмидесяти сантиметров высотой и восьмидесяти шириной. Чертежи устройства калитки и основания выполняются отдельно. Размеры определяются точно, чтобы избежать перекосов и перегибов при установке. На раме основной конструкции схематически размечается место калитки, планируется продольная балка для ее крепления. Располагается крепление в восьмидесяти сантиметрах от края.

Схема ворот из профнастила

Чертежу, по которому будут выполняться работы, свойственно указание не только размеров основного изделия, но и параметров комплектующих: навесов, замков, ручек. Воротам отводится функция центральной детали заборной композиции, поэтому дизайн профнастила необходимо сочетать с общим видом и цветом материала всего строения. Придать оригинальной конструкции воротам, облицованным профильным листом, можно в каждом отдельном случае, просмотрев различные варианты чертежей и выбрав оптимальное устройство.

Чертежам ворот присуща детализация каждой отдельной структурной единицы, поскольку точный расчет поможет сэкономить время, закупить нужное количество профнастила, расходных материалов, подготовить необходимый инструмент.

Необходимые инструменты

При сборке ворот необходимо использовать качественные строительные инструменты, чтобы избежать выбраковки материала и обеспечить прочность остова конструкции.

В работе понадобятся:

уровень для определения правильного расположения деталей ворот; строительный метр, с помощью которого произведутся замеры и разметки; сверла нужных размеров для успешной работы электродрели; ключ определенного размера для ввинчивания шурупов в профнастил; ножницы по металлу, необходимые для раскраивания профнастила согласно размерам; набор слесарных инструментов.

Необходимая фурнитура

Сборка основной конструкции

Рама ворот — несущая составляющая. При монтаже изделия, четко выверенные углы и жесткое крепление поперечных и продольных ребер жесткости, исключат перекосы всего сооружения после обшивки профнастилом. Монтировать основание необходимо в горизонтальной плоскости. Обеспечить надежный угол воротам поможет использование деревянной подложки под места скрепления профильного уголка или труб, чтобы предотвратить сдвиг балок относительно друг друга, а также укрепление сочленений металлическими косынками.

Конструкция ворот

Сборка воротного остова с помощью точечной сварки или специальных шурупов для профнастила зависит от желания и умения исполнителя. Собрать раму требуется полностью.

Процесс завершается врезкой замка и навешиванием петель, которые впоследствии установятся на основной конструкции забора. При этом необходимо смазать все движущиеся детали, чтобы избежать ржавления поверхностей после первого дождя. Профилактический осмотр и периодическая обработка петель и замков позволят продлить срок эксплуатации сооружения минимум на десятилетие.

  Как установить замок на калитку из профнастила?

Обшивка основания металлопрофильными листами

Окончательная отделка будущих распашных створок производится после установки каркаса в проеме. Особенность монтажа проявляется в раскройке металлопрофиля на детали, предусмотренные схемой. Ее необходимо выполнять при помощи ножниц по металлу, чтобы не повредить полимерное покрытие на профнастиле.

Качественную установку поможет произвести сверка с чертежом, где строго указаны все размеры конструкции

Полотна изделия постоянно подвергаются воздействию атмосферных явлений и перепаду температур. Поэтому нелишне будет обработать места соединения и шурупы специальным герметиком. Облицовка производится в основание волны листа, при высокой парусности через волну, небольшая ширина позволяет делать крепление через две волны.

Большей эстетической завершенности можно придать, используя заклепки. Внешний вид гораздо выиграет, но заменить деформированный лист в будущем немного проблематично из-за специфического крепления. Углы и края деталей выделяются при желании с помощью декоративных уголков контрастного цвета, дополняются коваными деталями, если дизайн гармонирует с основным видом здания и ограждения.

кованые ворота с профнастилом

Особенности установки заезда с откатом

Откат предполагает выполнение только одной створки ворот, при помощи специального механизма «отъезжающего» вперед и в сторону. Такой тип ворот предусматривается при ограниченных возможностях площади. Механизм устанавливается при помощи несложных манипуляций. Остальная организация работ практически не отличается от распашной системы и выполняется самостоятельно.

  откатные ворота из профнастила своими руками

Откатные ворота

Откатные ворота

Преимущества откатных ворот

Помимо очевидных — отсутствия ограничения по высоте, простоты конструкции и т. д. у откатных ворот есть и другие, не столь явные преимущества.

Цены на откатные ворота являются вполне приемлемыми для потребителей. Для широких проёмов это намного более экономный вариант, чем любые другие типы ворот, включая цельнометаллические распашные.

Во-вторых, они отлично работают при неблагоприятных погодных условиях. Ролики, размещённые внутри направляющего рельса, надёжно защищены от повышенной влажности и воздействия абразивных частиц. Это гарантирует то, что привод и автоматика откатных ворот будут работать без перегрузок. А это значит то, что срок службы в сложных условиях не будет уменьшаться.

Ещё одно важное, но далеко не столь очевидное преимущество — это их эстетические качества. На первый взгляд это кажется странным, но на деле лучшей альтернативы с точки зрения эстетики откатным воротам нет! По крайней мере если они применяются в качестве въездных на территорию. Единственная сопоставимая по потребительским качествам альтернатива в этом случае — это обычные распашные ворота. Очевидно, что если говорить о непрозрачных конструкциях, то откатные ворота одерживают в столкновении этих альтернатив явное преимущество.
Отделка откатных ворот

Раму, которая является основой откатных ворот, можно отделать самыми разными материалами. Классическим вариантом отделки является обшивка металлическим профилем, но это далеко не аксиома. На сегодняшний день в процессе изготовления откатных ворот используется популярная обшивка сайдингом. Преимущества этого материала — больший выбор цветовых решений и несколько большая долговечность по сравнению с металлическими листами.

Но и сайдинг и металлический профиль чаще применяются для отделки откатных ворот на предприятиях. Индивидуальные застройщики, которые щепетильно относятся к дизайну, сегодня предпочитают дерево и кованые решётки. Отделка деревом различных пород позволяет эффективно обыграть плоскость ворот и будет отличным выбором, если в оформлении забора также применятся дерево. Если же забор кирпичный или каменный, то многие выбирают такой нетривиальный вариант обшивки откатных ворот, как кованые решётки.

Рекомендации к откатным воротам

Инструкция по монтажу откатных ворот

Общая схема.

1. Несущий профиль

2. Несущая роликовая тележка

3. Полотно ворот

4. Столб опорный

5. Плато от бокового качения

6. Столб ответный

7. Уловитель нижний

8. Зубчатая рейка

9. Электропривод

 

Необходимые условия при изготовлении откатных самонесущих ворот: полотно ворот должно быть жестким, выдерживать ветровые и весовые нагрузки (в том числе изгиб под собственным весом). Направляющая приваривается к жесткому полотну.

 

Базовая комплектация для ворот консольного типа.

 

Состав базовой комплектации определяется исходя из веса устанавливаемых ворот, их габаритных размеров и варианта исполнения (глухие или решетчатые). Основным конструктивным элементом, определяющим работоспособность и обеспечение требуемых потребительских качеств изделия в течение всего срока службы, является направляющая. Критерием выбора направляющей является соответствие ее технических характеристик для выбранного полотна ворот. Комплектация ворот формируется исходя из выбранной направляющей.

 

В состав базового комплекта для изготовления откатных ворот входят:

1. металлический профиль — направляющая

 

2. две роликовые опоры

 

3. плато с роликами от бокового качения

 

4. ролик концевой

 

5. заглушка несущего профиля

6. уловитель нижний

 

 

Выбор направляющей и комплектующих.

Для изготовления откатных самонесущих ворот используются три типа направляющих. На их основе существует три базовых комплекта:

1. ЭКО (комплект для ворот весом до 200 кг)

 

2. НОРМА (комплект для ворот весом до 600 кг).

3. МАКС (комплект для ворот весом до 1200 кг).

 

F1 = F2 + P + Pt

F2 = (P*A/I — Pt)/2

 

Р — вес основной части воро

Pt — вес технологической части воро

F1 — сила тяжести действующая на роликовую опору 1

F2 — сила реакции, действующая на роликовую опору 2

A — ширина проема ворот

I — расстояние между центрами роликовых опор

B — высота ворот

 

Для правильного расчета конструкции откатных ворот важно вычислить величину F2, поскольку максимальное значение силы, действующей на роликовую опору, ограничено для каждой из направляющих.

 

Роликовая опора 1 должна устанавливаться как можно ближе к открытому проему (но следует предусмотреть место для установки концевого ролика). Расстояние между центрами роликовых опор (I) влияет на значение сил F1 и F2: если I увеличивается, то силы F1 и F2 уменьшаются. Для расчета расстояния между центрами роликовых опор рекомендуем воспользоваться формулой:

I = P*A / (2F2 + Pt)

Общие рекомендации.

Размеры и вес фундамента. Для нормальной работы ворот необходимо создать фундамент массой вдвое превышающей величину F1. Чтобы рассчитать массу фундамента достаточно умножить плотность бетона на объем. Плотность бетона приблизительно 2000 кг/м3.

 

1. Забор

2. Яма для бетонирования закладных под роликовые опоры

3. Яма для бетонирования закладных под ответный столб

Примечания: глубина выборки грунта в ямах для бетонирования = глубина промерзания + 200 мм

Закладная. Создать плоскость для монтажа роликовых опор рекомендуем посредством металлической сварной конструкции из швеллера (см. рис.)

 

Монтаж закладной производится согласно прилагаемой схеме.

Столб опорный. Рекомендуемая конструкция и необходимые допуски.

Столб ответный. Рекомендуемая конструкция.

Монтаж роликовых опор. Рекомендуется устанавливать роликовые опоры при помощи закладных болтов или на регулировочные площадки.

Направляющая. Сварочное соединение направляющая — каркас ворот рекомендуется выполнять следующим образом: с торцов полотна сварной шов выполняется непрерывным (с обоих сторон полотна ворот) длинною по 500 мм, а в средней части ворот достаточно применить точечную сварку с пятном сварки 30 мм — 50 мм и шагом 100 мм — 150 мм.

 

Ролики от бокового качения. В зависимости от вариантов исполнения полотна ворот существует два типа конструкций исключения бокового качения. Вариант 1: верхняя часть полотна ворот прямая, горизонтальная. В этом случае используется стандартное плато от бокового качения (см. рис.).

Вариант 2: верхняя часть полотна ворот фигурная или имеет пики. В таком случае с внутренней стороны ворот закрепляют П — образный профиль, а ролики, опираясь изнутри на его ребра исключают боковое качение (см. рис.).

для этого варианта рекомендуем устанавливать опорный столб следующим образом.

 

ЮКСЕЛЬ МЕНТЕСЕ САН. ТИЦ. ООО ŞTI., Двери внутренние домовые, замки для ворот на EUROPAGES.

ГЕОМЕТРИЯ МЕБЕЛЬ

Россия

Заводской значок Производитель/ Производитель

Компания «Мебель Геометрия» работает на рынке с 2005 года. На собственном производстве, расположенном в Москве, мы изготавливаем эксклюзивную мебель, прихожие, кабинеты, гардеробные, детские, спальни, шкафы и многое другое. За время работы компания реализовала более 1500 проектов – от небольших изделий до интерьеров загородных домов.Наша мебельная продукция имеет безупречный вид и отличное качество, благодаря: — Использование современных технологий производства в сочетании с ручной работой мастеров-профессионалов; — Накопленный опыт производства и собственные технологические и конструктивные решения, которых с каждым проектом становится все больше и больше; — Использование в производстве только лучших из представленных на рынке материалов, фурнитуры, аксессуаров, возможность применения большого ассортимента красок и декоров. Качество нашей продукции подтверждено: • сертификат соответствия ГОСТ РПО 2016:2019 (ВКС РАО 2016:2019) соответствие действующему законодательству РФ в области поставки продукции (работ, услуг), возможность поставки продукции (работ, услуг) требуемое качество в установленные договорами (контрактами, соглашениями) сроки; • сертификат соответствия №.ЭРСО.RU.0001.E0003105 Система менеджмента качества для производства прочей мебели. Соответствует требованиям ГОСТ Р ИСО 9001-2015 (ISO 9001:2015) • Декларация о соответствии техническому регламенту Таможенного союза ТР ТС 025/2012 «О безопасности мебельной продукции».

ЛУКА ГЛОБАЛ ГРУП SRL

Румыния

Значок магазина Мультикатегория

Древесина обладает особым качеством, помимо того, что это натуральный материал, ее можно обрабатывать и интегрировать в любой тип конструкции.Деревянные столярные изделия обладают неоспоримыми свойствами и повышают ценность везде, где они установлены. Наше видение основано на устойчивом и ответственном развитии на рынке. Вот почему мы берем на себя миссию предлагать — СТОЛЯРНЫЕ РАБОТЫ НА ВСЕГДА — Эта миссия коренится в ценностях нашего имени с момента его создания и передается всем тем, кто делает это возможным сегодня — нашим людям — от сотрудников, поставщиков и клиентов. Отпечаток Luca впечатляет долговечностью и инновациями, это то, что помогает нам быть первым выбором в выборе клиента.Luca Group была основана в 2010 году в Бухаресте вместе с командой профессионалов с большим опытом работы в этой области. Мы предлагаем широкий ассортимент столярных изделий, интерьера и экстерьера из дерева в постоянном развитии, в зависимости от предпочтений. Окна, межкомнатные и входные двери, межкомнатные ставни и лестницы. Мы постоянно инвестируем в людей и технологии, в рыночные инновации и в будущее, чтобы соответствовать нашим клиентам на уровне доверия и репутации. В этом смысле мы собрали портфолио со справочными работами в Румынии, а также в Европе — Франции, Германии, Швейцарии — Нашей целью является расширение рынка сбыта в Европе, и мы полны решимости стать лучшими деловыми партнерами для достижения этой цели!

ООО «ЛИБЕРТИ»

Россия

Заводской значок Производитель/ Производитель

Художественно-столярная мастерская «Свобода» производит межкомнатные двери, деревянную мебель и декоративные элементы для интерьера из массива дерева ценных пород. Компания производит оригинальные коллекции дверей для дома и современной мебели из массива дуба, ольхи, сосны, а также шпонированные изделия и изделия из МДФ: — распашные, раздвижные и складные двери для домов, — шкафы, книжные шкафы и полки, комоды, — столы, консоли и шкафы, — скамейки и стулья, — зеркала и другая мебель для интерьера, украшенная резьбой по дереву. «Либерти» также занимается проектированием и изготовлением мебели на заказ и выполняет отделку помещений деревом.В компании работает команда художников и дизайнеров, резчиков и краснодеревщиков, способных разработать самые разные проекты и воплотить их в жизнь. У нас можно заказать известково-меловую краску российской марки Arte di vita, которая используется для ремонтных работ в старых зданиях, для декоративной росписи стен, для создания художественного эффекта состаренной поверхности и «мокрой» краски. Мастерская изготавливает мебель для гостиниц, баров, кафе и ресторанов, бытовую мебель для гостиных, прихожих и вестибюлей, спален. «Свобода» готова к общению и рада сотрудничеству с архитекторами и дизайнерами. Вся продукция производится на современном оборудовании, с использованием качественных, экологически чистых материалов, сочетающих в себе индивидуальность и доступность, качество и простоту, долговечность и красоту.

Безопасность | Стеклянная дверь

Пожалуйста, подождите, пока мы проверим, что вы реальный человек. Ваш контент появится в ближайшее время. Если вы продолжаете видеть это сообщение, отправьте электронное письмо чтобы сообщить нам, что у вас возникли проблемы.

Veuillez терпеливейший кулон Que Nous vérifions Que Vous êtes une personne réelle. Votre contenu s’affichera bientôt. Si vous continuez à voir ce сообщение, связаться с нами по адресу Pour nous faire part du problème.

Bitte warten Sie, während wir überprüfen, dass Sie wirklich ein Mensch sind. Ихр Inhalt wird в Kürze angezeigt. Wenn Sie weiterhin diese Meldung erhalten, Информировать Sie uns darüber bitte по электронной почте и .

Даже Гедульд а.у.б. terwijl мы verifiëren u een человек согнуты. Uw содержание wordt бинненкорт вергегевен. Als u dit bericht blijft zien, stuur dan een электронная почта naar om ons te informeren по поводу ваших проблем.

Espera mientras verificamos Que eres una persona real. Tu contenido se sostrará кратко. Si continúas recibiendo este mensaje, информация о проблемах enviando электронная коррекция .

Espera mientras verificamos Que eres una persona real. Tu contenido aparecerá en краткийSi continúas viendo este mensaje, envía un correo electronico a пункт informarnos Que Tienes Problemas.

Aguarde enquanto confirmamos que você é uma pessoa de verdade. Сеу контеудо será exibido em breve. Caso continue recebendo esta mensagem, envie um e-mail para Para Nos Informar Sobre O Problema.

Attendi mentre verificiamo che sei una persona reale. Il tuo contenuto verra кратко визуализировать. Se continui a visualizzare questo message, invia удалить все сообщения по электронной почте indirizzo для информирования о проблеме.

Пожалуйста, включите Cookies и перезагрузите страницу.

Этот процесс выполняется автоматически. Вскоре ваш браузер перенаправит вас на запрошенный вами контент.

Пожалуйста, подождите 5 секунд…

Перенаправление…

Код: CF-102/6ea9a4958ffb3aad

человек, переживший землетрясение в Турции, был погребен под обломками

Выживший после землетрясения в Турции был погребен под обломками
Поддерживаемый молитвой, выживший после землетрясения Юксель Эр сказал: «Я никогда не думал, что меня не найдут. » (АП)
Ли Хокстейдер
Дипломатическая служба Вашингтон пост
Понедельник, 23 августа 1999 г.; Страница А1

БУРСА, Турция, 22 августа. В прошлый вторник было около трех часов ночи, когда Юксель Эр вышел из своей спальни, чтобы погасить свет в ванной. Эру, 40-летнему бухгалтеру, рано утром нужно было сесть на паром, и он спал беспокойно.

Затем случилась беда.Его квартира взорвалась, и в течение следующих 97 часов и 33 минут и более четырех дней мир Эра сводился к следующему:

Тяжелая дверь, пересекавшая его тело крест-накрест, висела в 10 дюймах над его туловищем. Комод за правым ухом и два маленьких кресла за левым. Ароматный аромат коллекции мыла его жены. Жгучая жажда, от которой пересохло горло и обветрились губы. И несколько часов муха, невидимая, жужжала над его головой, почти сводя его с ума.

Погребенный в руинах своей квартиры в результате сильного землетрясения, которое стерло с лица земли северо-запад Турции, Эр день и ночь лежал на спине в кромешной тьме размером не больше гроба. Он не мог ни перевернуться, ни сесть. У него не было ни еды, ни воды. Он фантазировал о том, чтобы выпить спрайта, но у него не было ничего, кроме собственной мочи, которая увлажняла губы. Он ничего не знал о своей семье. Он мечтал о небесах.

В течение 97 часов и 33 минут Эр медитировал, думал и молился. И тогда его молитвы были услышаны.Перед рассветом в субботу турецкая спасательная команда вытащила его из-под 15-футового обломка.

Эр, который живет в Ялове, к югу от Стамбула на восточном берегу Мраморного моря, был одним из последних выживших, которых вытащили из-под обломков одного из самых разрушительных землетрясений в истории Турции. Эксперты говорят, что люди, попавшие в ловушку, могут выжить около четырех дней, возможно, немного дольше, но только если они не пострадали и психологически устойчивы. После этого они обычно поддаются обезвоживанию.

У Эра было несколько преимуществ. Он около 6 футов 2 дюймов, чуть меньше 200 фунтов и довольно спортивный. Он везде ходит пешком и никогда не удосужился получить водительские права. Спокойный, находчивый и дисциплинированный, он умеренно ест и каждый год постится в священный для мусульман месяц Рамадан. У него есть духовная склонность, которая, кажется, придает ему спокойную уверенность.

«Я никогда не думал, что меня не найдут», — сказал он сегодня, лежа на больничной койке в городе Бурса. Однако сначала он не понял, что его поразило.Он только что вышел из ванной, когда землетрясение прогремело с оглушительным ревом, который длился 45 секунд.

«Это было ужасно, — сказал он. «Это было похоже на научно-фантастический фильм, когда огненный шар несется к вам и вышибает ваши двери. Я ясно видел, как он летит через окно в комнате моего сына. Он выглядел как красный огненный шар».

Входная дверь квартиры Эра на третьем этаже слетела с петель, и он схватился за нее, когда шестиэтажное здание рухнуло. Он падал и вращался «как в вихре, невероятно быстро», затем приземлился на кафельный пол, когда балки и обломки рухнули над дверью и мебелью, которая его защищала. Чудом у него была только одна травма; ноготь на его левом указательном пальце был сорван.

Окутанный тьмой и тишиной и запертый в своей пустоте, Эр был уверен, что Судный день настал. Но через несколько часов рассвело, и тяжелая техника начала курсировать по улицам вокруг развалин его квартиры. Эр мог слышать это, и он понял, что конец света не наступил.

Днем он насвистывал и стучал в стену, пытаясь привлечь к себе внимание, но все было напрасно. — крикнул он в отчаянии.В какой-то момент он почувствовал, как дует ветер, пока не понял, что это его собственное дыхание. Шли дни, и он молчал, чтобы сохранить свою энергию.

Он отсчитывал время по призыву муэдзина к молитве из соседней мечети и по звукам машин на улице. Когда уличный шум стих и в его склепе стало прохладнее, Эр понял, что сейчас ночь, и заснул. Когда стало жарко, он понял, что уже полдень.

После целого дня его ноги и бедра онемели.Но его руки были свободны, и, протянув руку в темноте, он почувствовал над собой стальную трубу. Ухватившись за это, он мог приподняться на несколько дюймов, достаточно, чтобы кровь циркулировала в его нижних конечностях и восстановилась чувствительность.

«Это очень помогло, это заставило меня понять, что я могу продержаться там какое-то время», — сказал он.

Большую часть времени он оставался наедине со своими мыслями. Он подумал о своей последней еде поздно вечером в понедельник, о окре и йогурте. Его голод достиг пика, затем исчез, но не раньше, чем он ненадолго задумался о том, чтобы съесть мыло своей жены.Он думал о своей семье и друзьях. Он с сожалением подумал о том, как сурово отругал своего 13-летнего сына Эсера за то, что в ночь перед землетрясением на шесть часов монополизировал семейный компьютер, «разговаривая» на английском с иностранными приятелями.

На четвертый день он подумал, или, вернее, одержим, о мухе, которая зажужжала вокруг его лица. А затем, около часа ночи в субботу, он услышал звук копания, неожиданно ближе, чем когда-либо ранее.

«Кто-нибудь там?» пришел голос.Это был его двоюродный брат. Когда Эр ответил, его двоюродный брат побежал за помощью и вернулся с сыном Эра, которого вытащили из-под обломков на следующий день после землетрясения. «Он сказал: «Папа, я больше никогда не буду тебя злить». И я сказал ему, что это не имеет значения, потому что все будет по-другому, когда я выберусь из-под обломков».

Взволнованный перспективой избавления, дух Эра воспарил. «Это был невероятный момент», — сказал он. «В тот момент я почувствовал себя достаточно сильным, чтобы провести еще 97 часов внутри».

Спасательная команда прибыла через несколько минут и сразу позвонила Эру, чтобы поднять ему настроение.- Он будет свободен через 30 минут, — крикнул руководитель группы. На самом деле потребовалось 3 часа, чтобы вытащить Эра через узкие зубчатые отверстия, через осколки стекла и мусор. В результате этого испытания его ноги были покрыты порезами и царапинами.

«Я чуть не сдался во время спасения», — сказал он. «В какой-то момент я просто махнул рукой и сказал: «Я остаюсь здесь».

Когда он вышел из руин в 4:35 утра, головой вперед и ползком, его ждали сотни людей. Когда они увидели, что он может ходить, они обрадовались.

«Первое, что я хотел сделать, это броситься к морю, хорошенько поплавать и в то же время сделать большой глоток воды», — сказал Эр. «Я мог бы убить даже за одну каплю воды».

Сегодня ликование по поводу его спасения несколько угасло. Он узнал о смерти своей жены и дочери, когда слушал интервью своего сына по телевидению в субботу вечером. «Я потерял мать, но, по крайней мере, у меня есть отец», — сказал он.

Он весь в синяках и слаб, и когда он жестикулирует рукой, то не может удерживать ее дольше одного мгновения.Когда он идет в ванную возле своей больничной палаты, он шаркает ногами 80-летнего, а не 40-летнего мужчины.

«Я начинаю вторую жизнь», — сказал Эр в окружении родственников и друзей в больнице. «Я просто попытаюсь извлечь из этого максимум пользы. Я хочу заслужить счастливую жизнь с людьми, которых люблю».

С этими словами Эр заплакал.

© 1999 The Washington Post Company

Вернуться к началу

Юксель Акчинар – член месяца SCN, апрель 2016 г.

Юксель АКЧИНАР — опытный консультант по технологиям, в настоящее время занимающийся администрированием SAP Basis, и наш член месяца SCN в апреле 2016 года.Находясь в Стамбуле, Турция, Юксель сделал разнообразную карьеру в области технологий SAP, недавно перейдя от разработки к системному администрированию. Он разделяет свою естественную страсть к обмену знаниями и обучению с SCN, отвечая на вопросы и публикуя информативные посты с практическими рекомендациями и документацию.

Он вдумчивый и усердный, и я нашел его личный девиз очень вдохновляющим в сегодняшнем быстром мире постоянных изменений;

«Каждая проблема — это возможность. Приготовьтесь к возможностям».


Расскажите нам немного о себе, где вы живете, чем вы занимаетесь и чем еще вы хотели бы поделиться с сообществом (хобби, забавные факты)?

Меня зовут Юксель АКЧИНАР. Я из Турции и живу в самом большом городе нашей страны в Стамбуле. Скажем, у Босфора. Я консультант по технологиям и в настоящее время работаю в технологической компании. До этого я работал в Ulker и Turkish Airlines в качестве руководителя группы Basis.Я работаю в Basis более 10 лет и участвовал во многих проектах SAP, в том числе во многих продуктах SAP на любых платформах.

Я также являюсь преподавателем технических курсов, таких как TADM10 и TADM12, HA200, TADM70, ADM506 и т. д. Я обучал консультантов BASIS не только в нашей стране, но и в Венгрии, Румынии и Марокко. Имею сертификаты по SAP BASIS, миграции ОС/БД и SAP HANA.

   Бейза и Эмре, Camlica Hill, Стамбул

Если я перейду на другую сторону жизни, то я женат на прекрасной, скромной, уважительной и терпеливой медсестре, у меня есть 16-летняя дочь и 9-летний сын. Я их очень сильно люблю. Я люблю читать и настоятельно поощряю своих детей к чтению. Мы ходим плавать раз в неделю с моим сыном. Сходите вместе в кино или посмотрите фильмы дома. Конечно, обмен на SCN также является одним из моих хороших увлечений в настоящее время.

Когда вы стали членом SCN и в каких областях вы наиболее активны?

На самом деле я основал SAP в 2006 году в качестве клиента и стал членом SCN (в то время sdn) только для целей поиска. Когда я начал работать в моей нынешней технологической компании, я стал активным участником SCN.Когда я был за границей с целью обучения, я решил написать о теме, которую я преподавал, и начал активно работать на SCN. Могу сказать, что настоящее членство начинается с этого решения в конце 2014 года. В основном я работаю в технических областях, таких как администратор NetWeaver, базы данных и менеджер решений.

   С коллегами по работе за завтраком

Что побуждает вас продолжать возвращаться в SCN и помогать участникам получать ответы на их вопросы?

Я всегда готовлю документы для своей работы, даже если она небольшая. (Я иногда жалуюсь на эту зависимость от документации. Но не могу остановиться.) И я помогаю своим коллегам по работе, делясь с ними своими документами. Как я уже говорил, я тоже тренер, мне нравится тренироваться.

   Юксель на тренировке

Таким образом, SCN является подходящим местом для меня и моей работы, чтобы делиться знаниями, опытом, помогать коллегам, расширять свои знания, пока вы делитесь. SCN — это первое место, на которое нужно смотреть, когда у вас возникают проблемы или когда вы хотите что-то настроить, установить.На нашем языке есть поговорка: «Обмен информацией увеличивает». Мне также нравится следить за дискуссиями замечательных участников на SCN. Это мотивирует меня, когда я пишу в SCN.

   С детьми

   С втулкой

Я вижу, вы недавно начали вести серию блогов о Solution Manager. Расскажите нам об истоках сериала и о том, что вы планируете дальше?

Я работаю в технологической компании, у которой более 50 клиентов.У большинства наших клиентов есть ландшафты SAP, и мы отслеживаем их системы SAP. SAP Solution Manager помогает нам поддерживать работоспособность систем. Таким образом, работа Solution Manager также является частью нашего долга перед заказчиками. Мы устанавливаем Solution Manager для всех клиентов, подключаем все, особенно производственные, системы к SM, выполняя Конфигурации управляемых систем.

Новые версии продуктов SAP всегда приносят радость. Они вызывают у нас энтузиазм по поводу их установки и наблюдения за изменениями.Когда я услышал о Solution Manager 7.2 на Ramp Up и увидел веселую команду, я решил, что должен сначала установить его в нашей компании и поделиться документацией, прежде чем он станет общедоступным для всех. И это было началом серии блогов. Я закончил 5 из них и планирую написать еще как минимум 5. Я хочу иметь пошаговые сервисы для ITSM, управления тестированием, управления процессами, управления компонентами в составе Solution Manager и делиться своим опытом в отношении этих функций.

   На Босфоре

   На тренировке в Вальдорфе

Расскажите другим коллегам, которые рассматривают подобный переход, о пути от разработчика до системного администратора. К чему вам было сложнее всего привыкнуть в новой роли?

Я начал свою карьеру в качестве разработчика. На самом деле я тоже очень люблю писать код.Проектирование, организация и интеграция процессов заставляют меня чувствовать себя счастливым и успешным. В 2006 году моя компания решила изменить ERP и заключила контракт с SAP. В те дни я тоже думал стать системным администратором. Я думал, что когда вы разработчик, вы должны иметь глубокие знания об инструменте разработки и языке, а также о функциональных процессах, для которых вы делаете разработку. В противном случае вам всегда понадобится функциональный консультант, который будет вас направлять. Когда я подумал об этом, мой менеджер спросил меня, хочу ли я быть парнем из BASIS. Шанс подошел к моей двери, поэтому я сказал, почему бы и нет? И это решение положило начало моей истории системного администратора.

Мне нравится быть системным администратором. Конечно, есть некоторые трудности, но когда работаешь с удовольствием, это не проблема. Одна из трудностей заключается в том, что вы должны работать ночью, в выходные или праздничные дни, особенно когда вы работаете с производственными системами. Планирование очень важно в этом виде работы. Если в вашей компании достаточно коллег, это не становится большой проблемой.

Во-вторых, технологии и продукты быстро меняются. Вы должны держать себя в курсе. Вы должны любить читать документы. Как я уже сказал, если вы получаете удовольствие от работы, вам повезло, и вы добьетесь успеха в том, что делаете.

За какой курс вы получили значок openSAP? Что вы думаете об опыте обучения на openSAP?

Я изучал быстрое развертывание решений SAP (обновление Q1/2015) для пакета HANA RDS и курсы SAP Netweaver Upgrades in a Nutshell. На openSAP у вас есть возможность послушать экспертов по openSAP на соответствующую тему. Есть задания для упражнений, страницы часто задаваемых вопросов, страницы вопросов и ответов. В конце вы можете получить запись достижения бесплатно.

Как консультант SAP, работающий с продуктами SAP, вы, должно быть, многое повидали. Что самое важное необходимо сделать SAP, чтобы поддерживать интерес клиентов к ее продуктам в будущем?

Клиенты знают о возможностях SAP. Но это не единственная причина, по которой клиенты выбирают SAP.Как технические ребята, я могу сказать, что производительность важна для клиентов. Клиенты хотят получать данные как можно быстрее. Особенно менеджеры не хотят использовать ноутбуки, ПК и хотят контролировать свои компании с помощью своих мобильных устройств. Отчеты, подтверждения, информационные панели и т. д. Таким образом, функциональные продукты должны обеспечивать клиентам мобильность, быстрый доступ к большим данным и экономическую эффективность.

Считаете ли вы, что ваш опыт участия в сообществе SCN помог вам продвинуться по карьерной лестнице и/или в профессиональной сети?

Да, я так думаю.У меня появились новые друзья в SCN, и я думаю, что в будущем их будет больше. Я буду встречаться с ними всякий раз, когда у меня будет возможность посетить форумы TechEd и SAP. И я верю, что после этой награды «Член месяца SCN» это станет более очевидным.

Есть ли член SCN, которым вы восхищаетесь (хорошо… вы можете назвать несколько)? И по какой причине?

Мне нравится, как SAP Mentors переписываются друг с другом и понимают друг друга. Я стараюсь следить за их разговорами на SCN. Мэтт Фрейзер, Елена Перфильева, Стив Рамсби, Юрген Л., Тэмми Поулас — имена, которыми я восхищаюсь.

Вы в Твиттере?

Да. @yakcnar — это мой аккаунт.

* * * * * * * * * *

Ежемесячно член SAP Community Network награждается за образцовое поведение: обмен знаниями с коллегами, помощь и выполнение дополнительных задач для поддержки участия сообщества. См. список предыдущих участников, признанных членами Зала славы Месяца SCN.

Клапаны с электроприводом и самовентилируемые каналы обеспечивают программируемое управление потоком и мониторинг в капиллярной микрофлюидике

.2020 17 апр;6(16):eaay8305. doi: 10.1126/sciadv.aay8305. Электронная коллекция 2020 апр.

Принадлежности Расширять

принадлежность

  • 1 IBM Research-Zurich, 8803-Rüschlikon, Швейцария.
Бесплатная статья ЧВК

Элемент в буфере обмена

Юльет Аранго и соавт. Научная реклама .

Бесплатная статья ЧВК Показать детали Показать варианты

Показать варианты

Формат АннотацияPubMedPMID

.2020 17 апр;6(16):eaay8305. doi: 10.1126/sciadv.aay8305. Электронная коллекция 2020 апр.

принадлежность

  • 1 IBM Research-Zurich, 8803-Rüschlikon, Швейцария.

Элемент в буфере обмена

Полнотекстовые ссылки Параметры отображения цитирования

Показать варианты

Формат АннотацияPubMedPMID

Абстрактный

Микрофлюидика необходима для многих приложений «лаборатория на чипе», но по-прежнему сложно реализовать портативное и программируемое устройство, которое может автономно выполнять протокол анализа при использовании человеком с минимальной подготовкой.Здесь мы представляем универсальную концепцию для достижения этой цели, реализуя программируемые жидкостные контуры, в которых жидкости в капиллярных микрожидкостных каналах можно контролировать и контролировать со смартфона для выполнения различных сложных задач по манипулированию жидкостями. Мы достигаем этого, комбинируя клапаны с электроприводом (e-gates) с пассивными капиллярными клапанами и самовентилируемыми каналами. Мы демонстрируем концепцию, внедряя микрофлюидные часы диаметром 5 мм, чип для управления четырьмя жидкостями с использованием 100 электронных вентилей с электронной обратной связью, а также конструкции для доставки и слияния нескольких жидкостей последовательно или параллельно в любом порядке и комбинации.Эта концепция является масштабируемой, совместимой с высокопроизводительным производством и может быть принята во многих анализах на основе микрофлюидики, которые выиграют от точного и простого обращения с жидкостями.

Copyright © 2020 Авторы, некоторые права защищены; эксклюзивный лицензиат Американской ассоциации содействия развитию науки. Претензий к оригинальным работам правительства США нет. Распространяется под некоммерческой лицензией Creative Commons Attribution 4.0 (CC BY-NC).

Цифры

Рис. 1. Программируемые жидкостные контуры, реализованные в…

Рис. 1. Программируемые жидкостные контуры, реализованные в капиллярной микрофлюидике.

Концепция управления, мониторинга, последовательной доставки,…

Рис. 1. Программируемые жидкостные контуры, реализованные в капиллярной микрофлюидике. Концепция управления, мониторинга, последовательной доставки и слияния нескольких жидкостей, протекающих в микрофлюидных чипах, с использованием массива микрофлюидных ворот с электрическим приводом (электронных ворот) и протокола, применяемого со смартфона. Жидкости, подаваемые пипеткой в ​​микрофлюидный чип с капиллярным приводом, автономно текут внутри микрофлюидных каналов под действием капиллярного эффекта до тех пор, пока поток не будет остановлен путем закрепления мениска жидкости в канавке, ортогональной пути потока.Течение возобновляется приложением разности потенциалов (

Рис. 2. Реализация программируемых жидкостных контуров…

Рис. 2. Реализация программируемых жидкостных контуров с использованием портативного периферийного устройства и смартфона.

Рис. 2. Реализация программируемых жидкостных контуров с использованием портативного периферийного устройства и смартфона.

( A ) Капиллярные микрофлюидные чипы с идентичным дизайном были вставлены в периферию, и 3 мкл PBS, содержащего синий краситель, были пипетированы в чипы (слева), электронные ворота были активированы вручную с помощью приложения для смартфона (в центре). ), и последовательности изображений микроскопа были захвачены во время построчной (чип 1) и столбцовой (чип 2) активации 12 электронных ворот (справа).Первое изображение микроскопа, полученное перед пипетированием жидкости (не показано), было вычтено из других, чтобы выделить положение жидкости на пути потока. ( B ) «Микрофлюидные часы», работающие автономно на основе протокола, применяемого с телефона. Слева — фотография чипа рядом с карандашом после пипетирования 3 мкл раствора PBS с красным красителем и перед установкой чипа в устройство. Жидкость протекла через канал шириной 100 мкм и длиной 15 мм и заполнила центр часов за 20 с (вставка: наклонная макрофотография закрепленного мениска на е-вороте шириной 200 мкм).Справа представлены микроскопические изображения чипа, в то время как электронные ворота автоматически активировались смартфоном каждые 5 минут, что соответствует минутам 1-часового циферблата (см. также фильм S4). Фото: Юксель Темиз, IBM Research – Цюрих.

Рис. 3. Механизм электрической обратной связи для…

Рис.3. Механизм электрической обратной связи для определения местоположения жидкостного мениска на основе…

Рис. 3. Механизм электрической обратной связи для определения местоположения мениска жидкости на основе измерений емкости электродов электронного затвора.

( A ) Изображения под микроскопом, показывающие три электронных ворот во время их последовательной активации (слева). Емкость каждого электронного затвора (C G ), т. е. емкость, измеренная между общим электродом в загрузочной площадке и электродом электронного затвора, измерялась непрерывно, за исключением времени активации электронного затвора (справа).(i) Емкости оставались на уровне 127 пФ до того, как жидкость достигла электронных ворот. (ii) C G2 увеличилась до 140 пФ после активации e-ворота 1 (не показано на изображениях микроскопа), и образец достиг e-ворота 2. (iii) затем был активирован E-ворот 2, и C G2 увеличена до 145 пФ за счет увеличения площади поверхности электрода, контактирующего с жидкостью. Емкости e-затвора 3 (C G3 ) и e-затвора 4 (C G4 ) показали аналогичное поведение, когда образец достигал e-затвора 3 (iv), после активации e-затвора 3 (v ), а жидкость достигла e-ворота 4 (vi).( B ) Блок-схема алгоритма, который можно использовать для автоматической активации электронных вентилей на основе обратной связи от измерений емкости. ( C ) Емкость, измеренная на двух е-затворах, показывающая изменение емкости (ΔC) после введения чипа, пипетирования образца, достижения менисков до е-затворов (i) и активации е-затворов (ii и iii). Изображения под микроскопом вверху подчеркивают положение менисков. Масштабная линейка, 500 мкм. Фото: Юксель Темиз, IBM Research – Цюрих.

Рис. 4. Эффективное управление несколькими жидкостями…

Рис. 4. Эффективное управление несколькими жидкостями с помощью параллельных электронных вентилей.

Инжир.4. Эффективное управление несколькими жидкостями с помощью параллельных электронных затворов.

( A ) Несколько жидкостей контролируются независимо путем применения разности потенциалов между электродом выбора жидкости (E L ), который расположен на загрузочной площадке, и электродом выбора e-gate (E N ), который является общим для всех жидкостей для данного положения и соединен с землей. К одним и тем же внешним контактам могут быть электрически подключены несколько электронных затворов, например, два последовательных электронных затвора, подключенных к одному и тому же электроду, как показано на рисунке.( B ) Фотография протестированного чипа, содержащего четыре независимых канала в гоночной конфигурации и 25 электронных вентилей на канал, которые подключены к 12 контактам. В верхней части показана конфигурация четырех загрузочных площадок, обеспечивающих подачу окрашенных растворов PBS в соответствующие каналы, и расположение электродов выбора жидкости (E L ), расположенных на загрузочных площадках. На вставке показано увеличенное изображение окрашенных образцов, контролируемых набором е-ворот и сфокусированных на желтом растворе: до прибытия к е-воротам (кадр А), остановка у е-ворот (кадр В) и прохождение через это после активации (кадр C).( C ) Верхний график показывает измерение емкости между электродом на указанном электронном затворе и электродом на загрузочной площадке для одного из растворов до того, как он достигнет электронного затвора [зеленый, рамка A на вставке (B )] и когда он остановится [красный, кадр B на врезке (B)]. Непрерывная вертикальная черная линия указывает на напряжение (5 В), приложенное для активации электронных ворот. На нижнем графике показана разница в значениях емкости при измерении до и после того, как мениск достигает электронного затвора.Фото: Юльет Аранго, IBM Research – Цюрих.

Рис. 5. Усовершенствованные жидкостные контуры и последовательные…

Рис. 5. Усовершенствованные жидкостные контуры и последовательная подача жидкостей, реализованные с использованием электронных вентилей и капилляров…

Инжир.5. Усовершенствованные жидкостные контуры и последовательная подача жидкостей, реализованные с помощью электронных затворов и капиллярных клапанов с воздухоотводчиками.

( A ) Концепция, показывающая несколько жидкостей, контролируемых электронными воротами и протекающих через общий канал в любой комбинации и любой последовательности. ( B ) Капиллярный клапан с вентиляционным отверстием позволяет объединять несколько жидкостей без образования пузырьков воздуха, в то время как потоки жидкостей контролируются электронными заслонками. На этом рисунке с двумя жидкостями жидкость 1 (L1) течет по каналу и соединена со вторым каналом через капиллярный клапан (слева).Поток жидкости 2 (L2) возобновляется активацией его электронного затвора (посередине). Затем он сливается с L1 на капиллярном клапане, выталкивая воздух через вентиляционное отверстие, которое имеет еще один клапан, предотвращающий попадание L2 в вентиляционное отверстие. Обе жидкости текут по общему каналу до тех пор, пока поток L1 не будет перекрыт пузырем, который образуется в результате гидролиза при приложении достаточно высокой разности потенциалов к e-затвору (справа). ( C ) Экспериментальные результаты, показывающие последовательное течение жидкостей через общий канал.(i) Растворы PBS четырех цветов (прозрачный, красный, зеленый и синий) пипеткой наносили на соответствующие загрузочные площадки и удерживали электронными воротами. Сначала инициировался поток PBS, отмеченный синим цветом, который заполнял общий канал и останавливался у клапанов, соединяющихся с другими каналами. Дополнительные э-затворы, расположенные после общего канала, использовались для направления жидкости в один из четырех выпускных каналов. (ii) Поток PBS, показанный синим цветом, был полностью заблокирован пузырем, созданным при подаче постоянного тока +15 В между электродом e-gate (положительный) и общим электродом в загрузочной площадке (заземление).Затем инициировали поток PBS, отмеченный красным, путем активации его электронного затвора, сливая его в общий канал через капиллярный клапан, удерживающий PBS, отмеченный синим цветом. (iii и iv) Аналогично оставшиеся две жидкости (зеленая и прозрачная) текли последовательно через общий канал после того, как поток предыдущей жидкости был перекрыт и активировались соответствующие электронные ворота. Стрелки, соответствующие цвету жидкости, указывают направление потока, и всю последовательность можно увидеть в фильме S5. Фото: Юксель Темиз, IBM Research – Цюрих.

Рис. 6. Самовентилируемые каналы и электронные затворы.

Рис. 6. Самовентилируемые каналы и электронные затворы.

( A ) Компоненты для…

, вид сбоку Инжир.6. Самовентилируемые каналы и электронные затворы.

( A ) Вид сбоку компонентов для электрогейтинга с использованием черной кремниевой площадки вместо желоба для реализации е-гейтов. ( B ) Изображения под микроскопом, показывающие прерывистое управление потоком жидкости. ( C ) Трехмерная (3D) визуализированная иллюстрация, показывающая жидкость 1, закрепленную на электронном затворе, и жидкость 2, сливающуюся с жидкостью 1 без образования воздушного пузыря благодаря боковым вентиляционным отверстиям, выполненным из черного силикона.( D ) Примеры слияния двух жидкостей, остановленных на электронных воротах (верхний кадр): изображения микроскопа слева показывают слияние без пузырьков после активации электронных ворот для жидкости 2, а изображения справа показывают случай где оба электронных ворот были активированы одновременно с помощью общего электрода (из фильма S8). Фото: Юльет Аранго, IBM Research – Цюрих.

Похожие статьи

  • Новые системы управления потоком в капиллярах: запорные клапаны.

    Менгес Дж., Меффан С., Доламор Ф., Фи С., Добсон Р., Нок В. Менгес Дж. и соавт. Лабораторный чип. 2021 5 января; 21 (1): 205-214. doi: 10.1039/d0lc00811g. Лабораторный чип. 2021. PMID: 33295906

  • Программируемый гидравлический резистор для микрожидкостных чипов с использованием массивов электрозатворов.

    Сальва М.Л., Темиз Ю., Рокка М., Аранго Ю.С., Нимейер К.М., Деламарш Э.Сальва М.Л. и соавт. Научный представитель, 21 ноября 2019 г .; 9 (1): 17242. doi: 10.1038/s41598-019-53885-w. Научный представитель 2019. PMID: 31754240 Бесплатная статья ЧВК.

  • Ручная микрожидкостная система для работы с жидкостями, управляемая смартфоном.

    Ли Б., Ли Л., Гуань А., Донг К., Руан К., Ху Р., Ли З. Ли Б и др. Лабораторный чип. 2014 21 октября; 14 (20): 4085-92. doi: 10.1039/c4lc00227j. Лабораторный чип.2014. PMID: 25182078

  • Капиллярная микрофлюидика в микроканалах: от микрофлюидных сетей к капиллярным цепям.

    Оланреваю А., Богран М., Яфия М., Юнкер Д. Оланреваджу А. и соавт. Лабораторный чип. 2018 7 августа; 18 (16): 2323-2347. дои: 10.1039/c8lc00458g. Лабораторный чип. 2018. PMID: 30010168 Рассмотрение.

  • Платформы Microfluidic lab-on-a-chip: требования, характеристики и приложения.

    Марк Д., Хеберле С., Рот Г., фон Штеттен Ф., Ценгерле Р. Марк Д. и др. Chem Soc Rev. 2010 Mar;39(3):1153-82. дои: 10.1039/b820557b. Epub 2010 25 января. Chem Soc Rev. 2010. PMID: 20179830 Рассмотрение.

Цитируется

3 статьи
  • Реконфигурируемые многокомпонентные микромашины, управляемые оптоэлектронным пинцетом.

    Чжан С., Эльсаед М., Пэн Р., Чен Ю., Чжан Ю., Пэн Дж., Ли В., Чемберлен М.Д., Никитина А., Ю.С., Лю Х., Нил С.Л., Уилер А.Р. Чжан С. и др. Нац коммун. 2021 9 сентября; 12 (1): 5349. doi: 10.1038/s41467-021-25582-8. Нац коммун. 2021. PMID: 34504081 Бесплатная статья ЧВК.

  • Одноклеточная микрожидкостная импедансная цитометрия: от необработанных сигналов до фенотипов клеток с использованием анализа данных.

    Онрадо С., Бисенья П., Свами Н.С., Казелли Ф. Онрадо С. и др. Лабораторный чип. 2021 5 января; 21(1):22-54. doi: 10.1039/d0lc00840k. Лабораторный чип. 2021. PMID: 33331376 Бесплатная статья ЧВК.

  • Исследование электрических характеристик микрожидкостного переключателя ускорения U-типа с использованием солевого раствора в качестве чувствительного электрода.

    Шэнь Т., Чен Ю., Чанг Дж., Чжан Дж., Лю С.Шен Т. и др. Датчики (Базель). 2020 10 декабря; 20 (24): 7062. дои: 10.3390/s20247062. Датчики (Базель). 2020. PMID: 33321709 Бесплатная статья ЧВК.

использованная литература

    1. Ягер П., Эдвардс Т., Фу Э., Хелтон К., Нельсон К., Тэм М. Р., Вейгл Б. Х., Микрофлюидные диагностические технологии для глобального общественного здравоохранения.Природа 442, 412–418 (2006). — пабмед
    1. Сакманн Э. К., Фултон А. Л., Биби Д. Дж., Настоящая и будущая роль микрофлюидики в биомедицинских исследованиях. Природа 507, 181–189 (2014). — пабмед
    1. Йео Л.Y., Chang H.-C., Chan P.P.Y., Friend J.R., Микрожидкостные устройства для биоприложений. Смолл 7, 12–48 (2011). — пабмед
    1. Ау А.К., Лай Х., Утела Б.Р., Фолч А., Микроклапаны и микронасосы для BioMEMS. Микромашины 2, 179–220 (2011).
    1. Хилбер В., Стимул-активные полимерные приводы для микрожидкостных устройств следующего поколения. заявл. физ. А. 122, 751 (2016).

Показать все 43 ссылки

LinkOut — больше ресурсов

  • Полнотекстовые источники

  • Разное

[Икс]

Укажите

Копировать

Формат: ААД АПА МДА НЛМ

Руя Юксель о том, почему брендинг городов должен сочетаться с социологией городов

Руя Юксель в этом интервью рассматривает брендинг городов с точки зрения социологии городов, напоминает нам о роли идентичности в связи с брендами территорий и объясняет, почему последовательность и долгосрочное мышление являются ключом к успеху.

Руя, помните ли вы, когда впервые услышали о брендинге города, и что вы тогда думали?

Это было где-то во втором семестре моей первой магистратуры (управление маркетингом) в Лондоне. Меня всегда интересовала идентичность бренда, но когда дело дошло до решения, что исследовать для моей диссертации, я хотел выйти за рамки традиционного брендинга продуктов или услуг.

Кроме того, архитектура, использование городских пространств и эмоциональная привязанность к местам долгое время были для меня увлекательными темами.Итак, брендинг города в некотором роде является детищем моего академического и личного интереса.

Я учился в университете, специализирующемся на более общем подходе к маркетингу и коммуникациям, поэтому мне пришлось самостоятельно изучать брендинг мест. Это была работа доктора Мифанви Трумана (который позже стал моим научным руководителем) по регенерации и брендингу городов, а также исследование доктора Михалиса Каварациса (который позже стал моим экзаменатором на докторскую степень) по переходу городского маркетинга на брендинг города. открыл для меня совершенно новую дверь.

Меня особенно увлекли междисциплинарные аспекты брендинга городов, но это также создало серьезную проблему для понимания масштабов этой области, особенно при дальнейшем изучении темы для моей докторской диссертации.

Как изменилось ваше отношение к брендингу городов с тех пор?

Уф… Я сейчас изучаю городскую социологию! Ха-ха!

Когда я только начинал, это было примерно в то время, когда слово «брендинг» активно использовалось городскими властями, а агентства по брендингу работали даже в самых маленьких городах Великобритании .Это была ошибочная надежда на то, что «одна формула подходит всем».

В то время меня беспокоила изоляция между областями городского дизайна и планирования, брендинга городов, социологии, государственной политики и психологии. Эти области сильно взаимосвязаны, но имеют разные точки зрения и акценты и часто конфликтуют друг с другом.

Что изменилось сейчас, я бы сказал, так это то, что эти области лучше осведомлены друг о друге, более инклюзивны, и мы видим больше междисциплинарных подходов.

Имея докторскую степень в области брендинга городов (Университет Брэдфорда, 2016 г.), какие выводы из ваших исследований вы считаете основными для практиков?

Важность органичного инклюзивного подхода к брендингу городов.

Многие сити-менеджеры и правительственные чиновники по-прежнему больше заинтересованы в поиске краткосрочных решений о том, как «продать» город инвесторам, полагая, что с привлекательным имиджем и планом продвижения все проблемы в конечном итоге будут решены.

На этом этапе крайне важно сначала понять, что город состоит из социальных отношений в пределах определенных географических границ, особенно между его жителями и предприятиями, и обладает определенной степенью емкости природных ресурсов.

Например, когда я проводил исследование Лидса (Великобритания) и Стамбула (Турция), было очевидно, что жители Лидса могут справиться с новым населением, а ресурсы города, транспортное сообщение и близость могут вместить крупные инвестиции бизнеса. Наоборот, Стамбул уже достиг точки насыщения, которая уже не позволяет существующим жителям и предприятиям быть счастливыми и довольными.

Видеть много людей на улице может означать безопасность в Лидсе, тогда как в Стамбуле это ассоциируется с хаосом и неизвестностью.

Мы часто говорим о позиционировании бренда, мощности и совместном творчестве. Эти концепции также являются ключевыми для брендинга городов, но требуют более всеобъемлющего подхода. Люди из Paris часто с гордостью называют себя парижанами. Это ключевой показатель совместного создания части парижского бренда, владения им и представления его посторонним с сильным чувством гордости.

Вы преподаете брендинг и маркетинг в университете. На ваш взгляд, чем эти две концепции отличаются в теории и как они применяются на практике?

Я могу найти много способов отличить их друг от друга, но если говорить проще, брендинг развивается вокруг идентичности, не обязательно создаваемой нисходящим подходом, но пониманием всех элементов, которые вызывают в воображении, их взаимосвязь и гармония. друг с другом, так и с внешними факторами.

Брендинг лежит в основе того, чего хочет достичь маркетинг, будь то продажи или осведомленность, поскольку он создает эмоциональную связь.

Ключевой областью ваших интересов является идентичность в городских пространствах и значение. Что вас увлекает в этой теме?

Дело в том, что мы имеем дело с этим динамичным, многогранным характером городов. Сейчас в городах проживает больше людей, чем в прошлом, и влияние городов на человеческую жизнь больше, чем раньше.

Будь то столичный город, привлекательный горизонт, исторический торговый город или город летнего отдыха, мы находимся в постоянной связи с городами, возможно, в большей степени, чем мы часто осознаем. Мы ищем какие-то нити, какую-то связь, чтобы идентифицировать себя с тем, где мы живем.

В этом заключается мой главный интерес, потому что есть города, на которые мы жалуемся, но называем их домом с гордостью, а другие удовлетворяют наши потребности, но мы не можем поместиться в них и скрыть/отрицать их как дома.

Какую роль играет идентичность в контексте брендинга города?

Мы не можем думать о брендинге ни в каком контексте, не зная, с чем мы имеем дело, что создаем или чем управляем. Это может быть намного проще для продуктов или услуг из-за аспектов осязаемости или стандартизации. Но для городов все сложнее.

Вот почему я решил изучать городскую социологию. Я бы сказал, что в ту минуту, когда мы говорим об идентичности в контексте города , брендинга , мы также изучаем человеческое поведение и отношения в городе.

Какие города, городские центры или районы вы бы назвали примерами передовой практики городского брендинга или создания мест?

Хороших примеров довольно много. На ум приходят Portland (США), New York City (США) и Manchester (Великобритания) с четким изображением и согласованным набором элементов идентификации, которыми нужно управлять. .

У всех нас есть идея, образ, когда мы говорим о Нью-Йорке или о том, как Манчестер за последние 20 лет построил себя из пепла.В какой-то степени мы можем сравнить Лидс и Портленд с их упором на «независимый» имидж. Это более распространено в Портленде с высокими барьерами для входа в сетевые магазины и супермаркеты; в Лидсе это проявляется в сильной поддержке местных независимых магазинов.

Что вы считаете основными трудностями при создании «правильного» брендинга города? Каких ловушек следует избегать градостроителям и сити-менеджерам?

Последовательность и долгосрочное мышление.Как я упоминал ранее, города спешат принять и применить стратегии брендинга в надежде, что это им поможет. Мы видели пример этого со спорным фонтаном в центре Брэдфорда, который обошелся в 24,4 миллиона фунтов стерлингов, но большинство витрин заколочено, и город выглядит пустым.

Или позиционирование бренда Барселона для туристов за счет местных жителей; он стал городом для туристов. Я думаю, что я пытаюсь выделить здесь это:

Брендинг предлагает городам большие возможности для процветания, если он используется как комплексный подход, а не как ажиотаж.

Какие темы исследований вы бы исследовали в следующий раз, если бы у вас было достаточно времени и денег?

За последние несколько лет мой интерес сместился в сторону точки зрения жителей, их участия и привязанности к тому месту, где они живут. Особое внимание я уделяю роскошным небоскребам и их влиянию на общественное участие в Нью-Йорке.

Нам всем так или иначе предлагают мечты о жизни в большом мегаполисе, но часто эти города перенасыщены своими базовыми предложениями как для существующих, так и для новых жителей, создавая больше проблем и потребностей, чем они могут себе позволить.

Я рассматриваю такие вопросы, как то, как новая роскошная высотная жизнь изолирует жителей, влияя на их участие и участие в жизни общества. И что еще более важно, какие городские пространства и социальные отношения (или их отсутствие) мы создаем, вкладывая большие средства в такие здания.

Несомненно, эти роскошные многоэтажки играют жизненно важную роль в создании имиджа города, а также способствуют его экономическому благополучию. Однако мой аргумент здесь против создания одномерного города.

Спасибо, Руя.

Свяжитесь с Ruya по телефону LinkedIn .


Вам понравилось наше интервью с Руей Юксель о брендинге городов и его связи с городской социологией? Спасибо, что поделились!

Аллостерическое связывание между α-кольцами 20S протеасомы

Сборка in vitro асимметричных 20S протеасом архей

Функциональные 20S CP архей могут быть собраны in vitro 21 путем смешивания и инкубации очищенных полноразмерных α-субъединиц и пропептида укороченные β-субъединицы, которые индивидуально экспрессируются в E.coli (дополнительный рисунок 1). При экспрессии и очистке отдельно α-субъединицы собираются в гомогептамерные кольца. Два α-кольца соединяются друг с другом, образуя тетрадекамерное двойное α-кольцо, в котором α-субъединицы в каждом кольце переплетаются с другими α-субъединицами, подобно тому, как они переплетаются с β-субъединицами в интактном кольце. нативный CP (дополнительный рисунок 1c – i и дополнительная таблица 1). Смешивание таких двойных α-колец с β-субъединицами, которые остаются в виде мономеров на протяжении всей очистки, вызывает разделение двойных колец α-тетрадекамера на два гептамерных α-кольца и приводит к сборке α- и β-субъединиц вместе в интактные CP.Как отрицательное окрашивание, так и криоэлектронная микроскопия отдельных частиц (крио-ЭМ) показывают, что CP, собранные in vitro, неотличимы от нативного рекомбинантного CP, собранного in vivo (дополнительные рисунки 1j и 2). Мы также подтвердили, что CP, собранные in vitro, протеолитически активны, а его ворота α-кольца могут быть активированы протеасомными активаторами, демонстрируя, что наш CP, собранный in vitro, функционален и активен (дополнительная рис. 1k).

Поскольку α-кольца могут быть гомогенно предварительно собраны с α-субъединицей одного и того же типа, можно смешивать два разных типа предварительно собранных α-колец с β-субъединицами для сборки CP с двумя разными типами α-субъединиц. кольцо на противоположных концах.Мы создали два разных типа α-колец с разными аффинными метками: один был получен путем совместной экспрессии двух полноразмерных α-субъединиц в одной экспрессионной плазмиде, один с His-меткой, а другой с меткой MBP, оба в C -конечная. Таким образом, такие собранные α-кольца содержат смесь двух разных аффинных меток для облегчения многоступенчатой ​​аффинной очистки. Второй тип α-кольца был сделан с одной меткой Strep-Tactin. (Мы обнаружили, что метки Strep-Tactin можно использовать несколько раз для аффинной очистки, а His- или MBP-метки можно использовать только один раз.) β-субъединица всегда имела С-концевую His-метку. Сайт расщепления протеазой был помещен перед всеми аффинными тегами. Сначала мы очистили предварительно собранные α-кольца, меченные His / MBP, с помощью аффинной колонки Ni-NTA и α-кольца, меченные Strep-Tactin, с помощью аффинной колонки со стрептококком. β-субъединицы очищали с использованием аффинной колонки Ni-NTA. Затем мы собрали интактные CP in vitro, смешав предварительно собранные α-кольца и β-субъединицы. Полученная популяция CP представляет собой смешанную популяцию, содержащую желаемые асимметричные CP с отчетливым α-кольцом на каждом конце (рис.1а). Для их очистки использовали двухэтапную схему аффинной очистки, сначала с помощью метки Strep-trap, а затем метки MBP. Таким образом были получены очищенные CP, которые содержат два разных типа α-колец (рис. 1a). После очистки все аффинные метки удаляли протеазным расщеплением.

Рис. 1: Схема сборки асимметричной протеасомы in vitro.

a Схема сборки и очистки асимметричного 20S CP in vitro. После сборки изображенной смешанной популяции предполагаемые асимметричные частицы очищали по схеме двухстадийной аффинной очистки. b Схематическое изображение типов асимметричных 20S CP, собранных in vitro, используемых в этом исследовании. c Схематическое изображение всех типов комплексов, покрытых RP, собранных и использованных в этом исследовании.

Используя эту стратегию, мы собрали 20S, которые содержат два различных α-кольца на противоположных концах. Один конец представляет собой дикий тип, а другой содержит точечную мутацию K66A. Остатки Lys66 в α-кольце образуют солевой мостик с С-концевым карбоксилатом активаторов, PA26 или PAN, и точечная мутация этого остатка в аланин или серин отменяет связывание активаторов 20,22 .Такие асимметричные CP, названные α WT ββα K66A , позволяют связывать активатор с α-кольцом дикого типа, но не с противоположным α-кольцом с мутацией K66A, что нарушает связывание любых активаторов, включая оба протеасомные АТФазы с С-концевым мотивом HbYX или активаторы 11S, такие как PA26 из Trypanosoma brucei 18,20 . Это позволило сформировать гомогенную популяцию протеасом с одинарной крышкой. В качестве контроля мы также собрали in vitro симметричные CP дикого типа α WT ββα WT для сравнения.Полный список комплексов, собранных in vitro, показан на рис. 1b.

В этом исследовании мы использовали три типа активаторов. Первая представляет собой гомогексамерную PAN-АТФазу дикого типа, гомологичную субъединицам Rpt-АТФазы в основании 19S в эукариотических протеасомах 26S. С-конец PAN содержит мотив HbYX (гидрофобный, тирозиновый и любая аминокислота), необходимый для связывания с α-кольцом и открытия его ворот 18 . При использовании PAN мы также вводили точечную мутацию R28L в соответствующее α-кольцо 20S CP.Эта мутация не влияет на гейтирование или протеолитическую активность, но усиливает связывание PAN с CP. Второй активатор представляет собой гептамерный PA26 с точечной мутацией E102A и последними восемью С-концевыми остатками, замененными последними восемью С-концевыми остатками из PAN (с мотивом HbYX), который мы назвали PA26PANc. PA26 представляет собой гептамерный активатор 11S из Trypanosoma brucei 23 . Точечная мутация E102A отменяет специфическое взаимодействие между так называемой петлей активации PA26 с петлей обратного поворота в 20S α-субъединице, тем самым устраняя способность PA26 активировать 20S протеасомы, открывая свои ворота.Вместо этого мотив HbYX с С-конца PAN, помещенный на гептамерный С-конец PA26PANc, выполняет открытие ворот 22 . Как показано ранее, PA26PANc активирует частицу CP таким же образом, как и PAN, за исключением того, что он симметрично взаимодействует с 7-кратным симметричным α-кольцом и, таким образом, позволяет избежать несоответствия симметрии между α-кольцом и активатором 19,22 . Третьим активатором является PA26 с единственной точечной мутацией V230F, который функционирует как PA26 дикого типа, но с повышенной аффинностью связывания с архейным 20S CP 22 (дополнительная таблица 2).Смешивание нашего CP, собранного in vitro, с этими активаторами привело к получению желаемых типов протеасом с одинарной или двойной крышкой (рис. 1c и дополнительная рис. 3).

Протеолитическая активность асимметричной протеасомы 20S

Мы стремились использовать асимметричный CP, собранный in vitro, для решения вопроса о том, обладает ли протеасома с одинарным кепированием полной пептидазной или протеазной емкостью протеасомы с двойным кепированием. С этой целью мы использовали два типа субстрата, LFP и GFP-ssrA. LFP представляет собой флуорогенный пептид из девяти аминокислот, который излучает флуоресценцию при протеолитическом расщеплении.Он может диффундировать в 20S архей и подвергаться протеолизу даже без активатора, но открытие ворот увеличивает его скорость проникновения. При открытии ворот α-кольца видно, что флуоресцентный продукт накапливается с большей скоростью, что согласуется с повышенным потоком пептидов LFP в камеру деградации 20S 18 . Связь между активностью пептидазы и количеством активатора позволяет оценить аффинность связывания активатора с CP (дополнительный рисунок 4 и дополнительная таблица 4).GFP-ssrA представляет собой свернутый белковый субстрат, содержащий очень стабильный и объемный β-бочонок GFP, который не может пассивно диффундировать в 20S для деградации, даже когда его ворота открыты. Для деградации GFP-ssrA требуется CP в комплексе с PAN-АТФазой; PAN гидролизует АТФ, разворачивая GFP-ssrA и активно перемещая разворачивающийся полипептид в смежные CP, где происходит протеолиз.

Используя PA26PANc в качестве активатора, мы сначала сравнили пептидазную активность асимметричного CP с активностью симметричного CP.Мы инкубировали отдельно 16 нМ асимметричного и симметричного 20S CP с 112 нМ PA26PANc, так что высокий процент 20S CP либо одиночно кэпирован как PA26PANc-α WT ββα K66A , либо дважды кэпирован как PA26PANc-α WT -PA26PANc, что подтверждается отрицательным окрашиванием EM (дополнительный рисунок 3a, b). Так как PA26PANc открывает ворота α-кольца, с которым он связывается, CP с двумя колпачками имеет открытые ворота обоих α-колец, а CP с одинарным колпачком предположительно имеет одни открытые ворота в α-кольце, которое несет активатор (названный проксимальным). ворота).При использовании пептида LFP в качестве субстрата пептидазная активность протеасомных комплексов с одинарным и двойным блокированием одинакова (рис. 2a и таблица 1).

Рис. 2: Деградация субстрата асимметричными протеасомами.

a Кинетика деградации пептида LFP симметричным (синий) и асимметричным (желтый) 20S CP отдельно, а также двойным (черный) и одинарным (красный) активатором PA26PANc. Было проведено три ( n  = 3) биологически независимых эксперимента. Для получения кривой используются средние значения, а планки погрешностей представляют собой стандартное отклонение. b Динамика деградации GFP-ssrA под действием PAN-α WT ββα K66A и PAN-α WT ββα WT -PAN, анализ с помощью SDS-PAGE, окрашенного кумасси синим. Опыт повторили два раза; каждый дал аналогичные результаты. c Динамика деградации GFP-ssrA под действием PAN-α WT ββα K66A и PAN-α WT ββα WT -PAN, проанализирована вестерн-блоттингом с антителом против GFP. Референтные белки MW предварительно окрашивали перед нанесением антитела против GFP.Опыт повторили два раза; каждый дал аналогичные результаты.

Таблица 1. Обобщение результатов k cat (1/мин), K M (мкМ) и V max (мкМ/мин) 2 LFP и асимметричной деградации пептида 2 КП без и с активаторами.

Далее мы сравнили АТФ-зависимую деградацию белкового субстрата GFP-ssrA асимметричным комплексом PAN-α WT ββα K66A или симметричным комплексом PAN-α WT ββα WT -PAN.Как и в случае с PA26PANc, мы использовали избыток PAN, чтобы гарантировать, что высокий процент 20S CP закрыт активатором (дополнительный рисунок 3c, d). Поскольку свободный PAN может разворачиваться, но не разрушать GFP-ssrA, зависящую от времени деградацию GFP-ssrA измеряли не по уменьшению флуоресценции GFP, а вместо этого с помощью SDS-PAGE-гель-анализа и вестерн-блоттинга против GFP (рис. 2b, c). и дополнительный рис. 5). Мы обнаружили, что PAN-α WT ββα K66A и PAN-α WT ββα WT -PAN разлагают GFP-ssrA с одинаковой скоростью.Этот результат предполагает, что только одна АТФаза необходима для полной активации CP для разворачивания и деградации свернутого белкового субстрата, или что два субстрата GFP-ssrA не разворачиваются одновременно двумя PAN-АТФазами на противоположных концах CP.

Одно из возможных объяснений как активности пептидазы LFP, так и результатов деградации GFP-ssrA на рис. 2 заключается в том, что дистальные ворота остаются закрытыми в асимметричном комплексе. С этой точки зрения наличие одного открытого затвора в CP не является ограничивающим этапом для диффузного входа в субстрат (LFP, PA26PANc) или для активного входа (GFP, PAN) и выхода протеолитических продуктов из камеры деградации.Если это так, то на общую скорость гидролиза пептида не будет сильно влиять то, открыты ли одни ворота или два. Альтернативное объяснение заключается в том, что связывания активатора с проксимальным α-кольцом достаточно, чтобы аллостерически открыть ворота противоположного α-кольца (называемые дистальным α-кольцом или воротами). В этом сценарии привязка одного RP открывает двое ворот. Эта идея была проверена путем определения конформации ворот дистальных α-колец в асимметричных протеасомных комплексах.

Конформация дистальных ворот в протеасомах, ассоциированных с PA26PANc

Мы определили ряд одночастичных крио-ЭМ структур собранного in vitro асимметричного CP с одним связанным активатором, PA26PANc-α WT ββα K66A и PAN-α WT ββα K66A (дополнительная таблица 3).Мы сделали это в присутствии или отсутствии субстратов, чтобы проверить, повлияет ли обработка субстрата на результат. При определении этих реконструкций мы применяли симметрию С7. Проксимальные и дистальные α-кольца были легко идентифицированы с использованием связанного активатора в качестве эталона. Разрешение всех реконструкций составляло около 3 Å, что было достаточно для выявления конформаций ворот каждого из двух α-колец, проксимального и дистального.

В эукариотических протеасомах 20S α-кольцо содержит семь гомологичных, но разных α-субъединиц, каждая из которых имеет свой N-конец.Через сложную сеть водородных связей эти N-концы образуют очень упорядоченные ворота 4 . В протеасоме 20S архей с гомогептамерными α- и β-кольцами N-концы семи идентичных α-субъединиц также образуют ворота, которые предотвращают попадание громоздких субстратов, таких как длинные пептиды или свернутые белки, в протеасому 20S для деградации 18 . N-концы семи α-субъединиц не могут образовывать структурно упорядоченные ворота за счет водородных связей. Во всех структурах 20S протеасом архей с закрытыми воротами первые девять остатков α-субъединиц обычно не разрешаются 19,20 .ЯМР-спектроскопический анализ конформаций ворот архей 20S показывает, что N-концевые хвосты белков α-субъединицы направлены вниз в закрытой конформации и вверх в открытой конформации. Однако из-за пространственных ограничений не все N-концы α-кольца в закрытых воротах могут быть размещены в нисходящей конформации 24 . В наших структурных исследованиях мы использовали тот же критерий, отслеживая направление заострения N-концевых хвостов α-субъединиц для оценки конформации ворот.Это основано на предыдущих исследованиях крио-ЭМ с одной частицей открытия ворот у архей 20S и ЯМР-исследованиях архей 20S с открытыми и закрытыми воротами (дополнительная рис. 6a, e). Этот критерий также используется в недавнем исследовании протеасомных комплексов архей 16 . Здесь мы использовали тот же критерий для определения конформации ворот дистального α-кольца, когда проксимальное α-кольцо связано с активатором (дополнительная рис. 6).

Сначала мы определили структуру PA26PANc-α WT ββα K66A с разрешением 2.9 Å без подложки LFP и 3,4 Å с LFP (рис. 3 и дополнительная рис. 7). В обеих структурах конформация проксимального α-кольца и двух β-колец очень хорошо соответствует кристаллической структуре симметричной протеасомы 20S дикого типа в комплексе с тем же активатором (PDB: 3IPM). Как показано в этой кристаллической структуре 22 , связывание гибридного активатора PA26PANc с α-кольцом вызывает вращение α-субъединицы, которое открывает ворота (рис. 3c–e). В обеих наших структурах (с LFP и без него) дистальное α-кольцо без активатора также демонстрирует особенности, соответствующие открытым воротам, при этом все N-концы смещены от поры и направлены вверх (рис.3е, з). Однако, в отличие от проксимальных ворот, ротация дистальных α-субъединиц отсутствует (рис. 3g). Скорее, конформация этого α-кольца хорошо совпадает с таковой в кристаллической структуре архейной протеасомы 20S в комплексе с PA26 (PDB: 1YAR 20 ), за исключением того, что ворота находятся в открытой конформации. Неожиданное наблюдение, что связывание PA26PANc с проксимальным α-кольцом открывает ворота дистального α-кольца, согласуется с аллостерическим действием. То, что открытие дистальных ворот не зависит от присутствия субстрата, означает, что присутствие субстрата или его активный протеолиз внутри β-кольца не опосредует наблюдаемый аллостерический эффект.

Рис. 3: Одночастичная крио-ЭМ структура комплекса PA26PANc-α WT ββα K66A .

a Крио-ЭМ реконструкция PA26PANc-α WT ββα K66A с разрешением 2,9 Å. Образцы готовили без присутствия субстрата LFP-пептида. b Проксимальное α-кольцо 20S CP. c Ленточная диаграмма проксимального α-кольца (зеленый), наложенного на α-кольцо в закрытой конформации без связанного активатора (фиолетовый).Обратите внимание, что они не перекрываются, что указывает на вращение, вызванное связыванием активатора. d Ленточная диаграмма α-субъединиц из проксимальных α-колец. N-конец a-субъединицы в пунктирной рамке указывает вверх в конформации открытых ворот. e Ленточные диаграммы α-субъединицы из проксимального α-кольца и взаимодействующей с ним β-субъединицы (зеленый), наложенные на ленточную диаграмму α/β-субъединиц из 20S CP без связывания с активатором (фиолетовый). Обратите внимание, что β-субъединица идеально выровнена между ними, но α-субъединица повернута. f Дистальное α-кольцо 20S CP. г Ленточная диаграмма дистального α-кольца (зеленый), наложенного на α-кольцо в закрытой конформации без связанного активатора (фиолетовый). Обратите внимание, что они хорошо перекрываются. h Ленточная диаграмма α-субъединиц от дистальных α-колец, где N-конец α-субъединицы в пунктирной рамке указывает вверх в конформации открытых ворот.

Конформация дистальных ворот в PAN-ассоциированных протеасомах

Мы также определили структуры PAN-α WT ββα K66A в присутствии АТФ, без субстрата GFP-ssrA и с ним, как с разрешением 3.4 Å (рис. 4 и дополнительный рис. 8). Из-за несоответствия симметрии между гептамерным α-кольцом и гексамерной PAN-АТФазой PAN не взаимодействует с α-кольцом симметрично, и не каждый связывающий карман в CP занят C-концом PAN. Кроме того, взаимодействие PAN и α-кольца неоднородно среди разных частиц 17 , и такая неоднородность ограничивает достижимое разрешение. Чтобы получить достаточное разрешение для оценки конформации ворот, мы применили симметрию C7. Таким образом, плотность ПАН на этой реконструкции не отражает его правильную структуру.Поскольку это не является целью данного исследования, мы не пытались получить структуру ПАН с высоким разрешением, связанную с СР. Конформация проксимальных ворот (а также, предположительно, дистальных ворот) представляет собой среднее значение слегка отличающихся конформаций α-субъединиц внутри кольца. Даже в этом случае конформация ворот на симметричной карте плотности C7 по-прежнему представляет состояние ворот. Будь то без субстрата или с субстратом, проксимальные ворота находятся в открытой конформации, что согласуется с открытием ворот с помощью С-конца PAN с его нативным С-концевым мотивом HbYX.Кроме того, карта усредненной плотности по симметрии C7 все еще показывает вращение α-субъединиц, индуцированное связыванием C-концов PAN. Этот результат (рис. 4) с использованием PAN согласуется со структурами, определенными с PA26PANc (рис. 3). Таким образом, структуры PA26PANc-α WT ββα K66A и PAN-α WT ββα K66A показывают, что ворота дистального α-кольца открыты даже без прямой связи с активатором; эти дистальные ворота открываются аллостерически за счет взаимодействия активатора с проксимальным α-кольцом.Эти данные указывают на то, что RP, несущий мотив HbYX, который интеркалирует внутри карманов между соседними парами α-единиц и индуцирует небольшое вращение в α-единице для открытия ворот, может обеспечивать открытие аллостерических ворот.

Рис. 4: Одночастичная крио-ЭМ структура комплекса PAN-αWTββα K66A с субстратом GFP-ssrA.

a Крио-ЭМ реконструкция PAN-α WT ββα K66A с субстратом GFP-ssrA с разрешением 3,4 Å. b Проксимальное α-кольцо 20S CP. c Ленточная диаграмма проксимального α-кольца (серый цвет), наложенного на α-кольцо в закрытой конформации без связанного активатора (фиолетовый). Обратите внимание, что они не пересекаются. d Ленточная диаграмма α-субъединиц из проксимальных α-колец. N-конец α-субъединицы в пунктирной рамке указывает вверх в конформации открытых ворот. e Ленточная диаграмма α-субъединицы из проксимального α-кольца и взаимодействующей с ней β-субъединицы (серый цвет), наложенная на ленточную диаграмму α/β-субъединиц из 20S CP без связывания с активатором (фиолетовый).Обратите внимание, что β-субъединица идеально выровнена между ними, а α-субъединица повернута. f Дистальное α-кольцо 20S CP. г Ленточная диаграмма дистального α-кольца (серый), наложенного на α-кольцо в закрытой конформации без связанного активатора (фиолетовый). Обратите внимание, что они хорошо перекрываются. h Ленточная диаграмма α-субъединиц дистальных α-колец. N-конец a-субъединицы в пунктирной рамке указывает вверх в конформации открытых ворот.

Дистальные ворота в протеасомах с использованием PA26 без мотива HBYX

Чтобы проверить, является ли мотив HbYX необходимым элементом для индукции аллостерической связи между двумя удаленными α-кольцами, мы дополнительно определили структуру асимметричного CP α WT ββα K66A в комплексе с одним PA26, у которого нет мотива HbYX, привитого к его С-концу.Как и ожидалось, ворота в проксимальном α-кольце открыты, и вращение α-субъединицы отсутствует, но петля активации PA26 взаимодействует с петлей обратного поворота CP (рис. 5 и дополнительная рис. 9). В отличие от результатов с использованием PAN и PA26PANc, в асимметричной протеасоме, несущей PA26, ворота дистального α-кольца закрыты. Этот результат указывает на то, что связывание протеасомного активатора без С-концевого мотива HbYX с одним α-кольцом открывает только проксимальные ворота, но не вызывает аллостерическое открытие дистальных ворот.

Рис. 5: Одночастичная крио-ЭМ структура комплекса PA26-α WT ββα K66A без подложки.

a Крио-ЭМ реконструкция PA26-α WT ββα K66A с разрешением 3,5 Å. b , e Проксимальное и дистальное α-кольцо 20S CP. c , f Ленточная диаграмма α-субъединиц проксимального и дистального α-колец. Обратите внимание, что N-конец проксимальной α-субъединицы направлен вверх, что соответствует конформации открытых ворот.Напротив, N-конец дистальной α-субъединицы направлен вниз, что согласуется с конформацией закрытых ворот. d Ленточная диаграмма α-субъединицы из проксимального α-кольца и взаимодействующей с ней β-субъединицы (серый цвет), наложенная на лентовидную диаграмму α/β-субъединиц из 20S CP без связывания с активатором (фиолетовый). Обратите внимание, что как α-, так и β-субъединицы хорошо выровнены между ними. г Кинетика деградации LFP симметричным (синий) и асимметричным (желтый) 20S CP отдельно и с двойным (черный) и одинарным (красный) активатором PA26.Было проведено три ( n  = 3) биологически независимых эксперимента для получения среднего значения и стандартного отклонения. Для получения кривой используются средние значения, а планки погрешностей представляют собой стандартное отклонение.

Эти результаты побудили нас к дальнейшему тестированию пептидазной активности асимметричного CP с одной кепкой PA26 по сравнению с активностью симметричного CP с двумя кепками PA26. Если скорость диффузии пептида LFP через открытые ворота в CP является стадией, ограничивающей скорость, пептидазная активность симметричного CP, дважды закрытого PA26 (две открытые ворота), должна быть выше, чем активность асимметричного CP, закрытого только одним PA26. одни ворота открыты).Действительно, пептидазная активность симметричного CP, дважды заблокированного PA26, примерно в два раза выше, чем у асимметричного CP с одинарным блокированием (рис. 5g и таблица 2), как и предполагалось на основании структур и заявленной гипотезы. Этот результат также предполагает, что скорость диффундирования развернутых пептидных субстратов через открытые ворота в протеолитическую камеру является стадией, ограничивающей скорость пептидазной активности протеасомы 20S.

Таблица 2 В таблице приведены k cat (1/мин), K M (мкМ) и V max (мкМ/мин) кинетические параметры асимметричной пептидазной активности и 20S CP без и с активатором PA26.

Совместное связывание, связанное с дистальным открытием ворот

Связывание регуляторного колпачка с α-кольцом способствует локальному открытию ворот. В случае активатора с С-концевым мотивом HbYX, такого как PAN или PA26PANc, дистальные ворота также открываются аллостерически. Такое незанятое α-кольцо с аллостерически открытыми воротами, в котором N-концы всех α-субъединиц отодвинуты от поры и направлены вверх, может кинетически способствовать связыванию активатора по сравнению с α-кольцом, которое в остальном идентично, но с закрытыми воротами.Пустые и открытые дистальные ворота предварительно сконфигурированы для приема активатора. Эта гипотеза делает проверяемый прогноз: связывание PAN или PA26PANc с CP является кооперативным, но связывание PA26 с CP не является кооперативным. Кооперативное связывание RP подразумевает, что распределение среди незакрытых, одинарных и двойных запечатанных частиц будет показывать дефицит одинарных запечатанных CP и соответствующее увеличение незакрытых и дважды запечатанных частиц. Интересно, что такое совместное связывание эукариотических 19S с 20S было описано для эукариотических протеасом 25 .

Чтобы проверить эту гипотезу, мы собрали электронные микрофотографии отрицательно окрашенных симметричных CP дикого типа, инкубированных либо с PA26PANc, либо с PA26 в двух различных молярных соотношениях, 4:1 и 3:1. Мы выбрали все частицы CP, с крышками или без них, и классифицировали их на три категории: только CP и с одним или двумя связанными активаторами (дополнительный рисунок 10). Вероятность связывания кэпа с α-кольцом, P , оценивали по количеству частиц в каждой категории. Гипотеза некооперативного связывания кэпа с CP предсказывает биномиальное распределение частиц в каждой категории: P 2 для дважды связанного CP, 2 P (1 −  P ) для одинарно связанного CP и ( 1 −  P ) 2 для несвязанного CP (таблица 3 и дополнительные таблицы 5 и 6).Сравнивая наблюдаемое и предсказанное количество частиц с одинарной крышкой, PA26PANc с одной крышкой значительно меньше, чем предсказывает нулевая гипотеза. Такой дефицит одношапочных комплексов является признаком положительной кооперативности. Нулевая гипотеза была отвергнута с высокой вероятностью анализом х 2 . Однако аналогичный анализ с PA26 не выявил признаков положительной кооперативности.

Добавить комментарий

Ваш адрес email не будет опубликован.